The Plant Journal连发两文，4D蛋白质组学“牛刀小试”，揭示植物缺水逆境胁迫/铁-硫代谢新机制

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近日，植物学领域专业期刊The Plant Journal发表题为Expression of a dominant-negative AtNEET-H89C protein disrupts iron-sulfur metabolism and iron homeostasis in Arabidopsis的论文。美国密苏里大学Ron Mittler团队基于timsTOF Pro质谱仪的4D蛋白质组学以及靶向蛋白质组学，结合转录组学分析，对拟南芥中AtNEET蛋白的功能进行深入探讨，揭示了AbNEET蛋白在拟南芥中调节铁-硫代谢和铁稳态中的重要作用及分子机制。

铁-硫(Fe-S)簇在植物的多种代谢和调节通路中都发挥着重要作用。它们在细胞内的合成和调动受到非常严格的调节，保护和区域划分。最近发现了一组哺乳动物中的2Fe-2S蛋白，称为NEET蛋白，它们被认为通过调动2铁-2硫(2Fe-2S)簇从线粒体向细胞质转移在很多人类疾病中扮演重要角色。AtNEET蛋白是拟南芥NEET蛋白家族中唯一的成员，可定位在植物细胞的线粒体和叶绿体中，被猜测在保持拟南芥铁元素和活性氧（ROS）稳态的过程中发挥重要作用。尽管拟南芥AtNEET蛋白可能与人类NEET蛋白在功能发挥层面有一些相似性，但是关于它在植物中的具体功能仍不清晰。

本文中，研究人员发现扰乱AtNEET的功能将破坏2Fe-2S簇从叶绿体2Fe-2S生物发生途径向不同的胞质和叶绿体Fe-S蛋白以及细胞质Fe-S生物发生系统的转移。而这个的结果就是铁元素在叶绿体中的累积以及活性氧(ROS)积累。研究者进一步证明了AtNEET将其2Fe-2S团簇转移到DRE2（细胞质中Fe-S簇合成系统中的关健蛋白），并提出在叶绿体和胞质中2Fe-2S团簇的有效性与植物体内铁稳态有关。

AtNEET蛋白在拟南芥中调控铁-硫代谢

值得一提的是，日前The Plant Journal上发表题为The Complex Response of Free and Bound Amino Acids to Water Stress During the Seed Setting Stage in Arabidopsis的论文，密苏里大学Christopher S. Bond生命科学中心Ruthie Angelovici教授课题组运用基于timsTOF的4D蛋白组学技术，结合代谢组学等技术揭示了拟南芥结籽期应对不同类型缺水胁迫的机制。

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离子淌度分离的引入使得蛋白质组学进入了4D新时代。和常规的3D蛋白组相比，新一代的4D蛋白质组学充分利用了第四维离子淌度（ion mobility）的信息，实现了更加specific的匹配，在扩大检测深度的同时提高了准确性，独特的性能使其成为蛋白组学复杂样本深入研究的利器，使得许多其他科学问题与临床运用的探索成为可能。4D蛋白质组学研究成果的接连发表，无疑也说明全新一代4D蛋白质组学技术作为新技术，进入了蓬勃发展的新阶段。

研究速读

1、 拟南芥AtNEET突变影响其抽薹和生长

为了干扰拟南芥AtNEET的正常功能，作者采用显性负性突变（一对等位基因中因其中一个突变或丢失所致的另一个正常等位基因的功能活性丧失，突变后的蛋白会导致野生型蛋白功能改变或丧失）的方法构建了拟南芥突变株H89C。通过对H89C突变株，过表达NEET植株以及野生型植株的生理指标观测，作者发现过表达H89C蛋白后，拟南芥的生长状态明显收到影响，出现明显的萎黄病，幼苗死亡率提高，并且抽薹提前(Figure 1)。

Figure 1. AtNEET突变影响拟南芥生长形态

二、H89C过表达引起的拟南芥基因表达趋势的改变

为了更好的解释AtNEET的功能以及突变后生长表型的抑制问题，作者对7天的拟南芥幼苗（H89C突变株，过表达NEET植株以及野生型，各3次生物学重复）进行了转录组学检测。结果显示，在过表达NEET植株中和H89C突变株中均有大量的mRNA表达量产生显著上下调，但俩者间的重叠部分很少（Figure 2a）。以功能或生物学过程而言，H89C突变株表达量上调的基因中，显著参与到活性氧响应转录因子及调控网络中，并且其中许多基因同样在H2O2处理的拟南芥植株内呈现上调趋势（Figure 2b）。除此之外，作者还鉴定到在过表达H89C的植株中，拟南芥叶片中的缺铁响应被部分激活（Figure 2c），并且各个亚细胞结构中一些参与到Fe-S生物发生过程的基因都表达量显著上调（Figure 2d）。然而这些结果在过表达NEET植株中并没有呈现相似趋势。

Figure 2. H89C突变株的基因表达变化

三、蛋白质组学揭示H89C降低了Fe-S蛋白量

为了探讨H89C是否阻断了一些Fe-S簇从Fe-S生物发生途径向Fe-S蛋白的转移， 降低细胞内Fe-S蛋白的含量从从而表现出缺铁/铁-硫的状态。作者利用基于timsTOF的4D蛋白质组学技术对过表达NEET或H89C的植株分别进行检测。相对于NEET植株，H89C过表达导致一些Fe-S蛋白的含量明显下降，甚至一些mRNA表达上调的基因在蛋白层面确是下调趋势（Figure 3a）。一些线粒体呼吸集团相关的蛋白丰度上调，与此同时大量叶绿体中蛋白的下调（Figure 3b），意味着在H89C植株可能通过线粒体呼吸作用的增强来补偿叶绿体功能的部分缺失（Figure 3c）。除此之外，作者又通过基于MRM的靶向蛋白质组学技术确定H89C主要是降低了了2Fe-2S蛋白的表达。

Figure 3. H89C降低了Fe-S蛋白表达量并影响了叶绿体功能

四、H89C拟南芥叶片出现铁元素累积并干扰了2Fe-2S团簇向DRE2转移

为了进一步探索H89C突变即AtNEET功能受阻对拟南芥的影响，作者通过Pearl's染色等方法发现有大量的铁元素累积到H89C过表达拟南芥叶片中(Figure 4a)。然后又通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)试验，观测到正常AtNEET可将其2Fe-2S团簇转移到DRE2（细胞质中Fe-S簇合成系统中的关健蛋白），而H89C不能(Figure 4b)。

Figure 4.铁元素累积并干扰了2Fe-2S团簇向DRE2转移

综上所述，本文利用基于timsTOF Pro质谱仪的4D蛋白质组学以及靶向蛋白质组学，结合转录组学分析，共同对拟南芥AtNEET蛋白的功能进行深入探讨。研究发现当AtNEET正常功能被干扰后，可引发叶片相关的铁-硫和铁缺乏反应、叶绿体中铁含量升高、叶绿体结构损伤、萎黄病等一系列植物的生理形态改变。扰乱AtNEET的功能阻止了其将2Fe-2S团簇转移到DRE2。而这些结果充分证明了AtNEET对拟南芥铁-硫代谢以及稳态调控的重要作用。

参考文献

Sara I. Zandalinas., et al., 2019, Expression of a dominant-negative AtNEET-H89C protein disrupts iron-sulfur metabolism and iron homeostasis in Arabidopsis. The Plant Journal.

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